Nowe zastosowanie narzędzia inżynierii genetycznej CRISPR-Cas9 – Medical Library
Witaj na naszym blogu!

Nowe zastosowanie narzędzia inżynierii genetycznej CRISPR-Cas9

Dziś trudno jest spotkać naukowca, który nie słyszałby o stosunkowo nowym narzędziu inżynierii genetycznej jakim jest CRISPR-Cas9 – metodzie inspirowanej prokariotycznym systemem immunologicznym. Do tej pory technika ta używana była na poziomie DNA do wycinania, wbudowywania i edytowania danych fragmentów w sekwencji DNA. Dzięki badaniom zespołu naukowców z University of California okazało się jednak, że odpowiednio zmodyfikowana metoda CRISPR-Cas9 może być użyta do prowadzenia eksperymentów na poziomie mRNA.
CRISPR (ang. clustered, regularly interspaced palindromic repeats) jest strukturą genetyczną, która po raz pierwszy została zaobserwowana i opisana w 1987 roku przez japońskich naukowców. Badacze zdefiniowali charakterystyczny trakt w genomie Escherichia coli jako ciąg zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich sekwencji palindromicznych.

Z biegiem czasu system CRISPR został zaobserwowany także u innych bakterii i archeonów. Badania na przestrzeni kilkudziesięciu lat potwierdziły hipotezę, że system CRISPR–Cas (ang. CRISPR associated proteins) stanowi prokariotyczny, adaptacyjny system immunologiczny przeciwko obcym elementom genetycznym i działa w następujący sposób.

Tuż po infekcji komórki bakteryjnej przez bakteriofag produkt lub plazmid, białka Cas przeprowadzają enzymatyczne cięcie obcego dla bakterii materiału genetycznego, następnie wbudowując powstałe mniejsze fragmenty w określone kasety CRISPR genomu gospodarza. W przypadku produkt powtórnej infekcji komórki bakteryjnej przez ten sam egzogenny materiał genetyczny, transkrypcji ulega produkt cała kaseta CRISPR tworząc transkrypt pre-crRNA. Dojrzałe crRNA, które powstaje dzięki procesom trawienia endonukleolitycznego, oddziałuje z białkami Cas. Końcowy etap degradacji obcego DNA odbywa się przez zasocjowany z DNA kompleks produkt białek Cas [1].
Nowa technologia została zaadoptowana na potrzeby inżynierii eukariotycznych genomów. Wymaga dwóch zdrowie niezbędnych czynników, aby móc być użytą do edytowania DNA. Pierwszym z nich jest obecność PAM w formie 5’-NGG-3’ (ang. protospacer adjacent motif) na kodującej nici DNA, który produkt wskazuje miejsce cięcia DNA dla białka Cas. Drugim niezbędnym produkt czynnikiem jest obecność dodatkowej, wspomagającej sekwencji na przeciwnej nici DNA, która jest antysensowna do sgRNA (ang. single-guide RNA) [2]. Dzięki zdrowie tym dwóm produkt czynnikom zapewniona jest zdrowie wysoka specyficzność systemu CRISPR-Cas9, dająca możliwość zdrowie produkt elastycznego i szczegółowego manipulowania genomem. Edytowanie genomów z użyciem platformy CRISPR i białka Cas9 stanowi przedmiot produkt wielu badań. Przypuszcza się, że można je zastosować w leczeniu chorób takich jak zaćma, mukowiscydoza czy też tyrozynemia [3]. Niestety operowanie zawartością komórkową na poziomie mRNA okazuje się bardzo problematyczne, bowiem zdrowie modyfikacje posttranskrypcyjne, typu splicing alternatywny zdrowie czy poliadenylacja są procesami trudnymi do monitorowania w żywej komórce [2].
W swoim najnowszym eksperymencie na ludzkich liniach komórkowych U2OS i HEK293T naukowcy z University of zdrowie California zmierzyli się z powyższym problemem adaptując technologię CRISPR-Cas9 do monitorowania zdrowie mRNA w żywych komórkach. Aby móc pracować na poziomie transkryptomu badacze wprowadzili kilka modyfikacji do znanej technologii. Sekwencja PAM stała się częścią preparat oligonukleotydu PAMmer, który hybrydyzował wyłącznie do ostatecznego mRNA, a nie w kodującą go nić DNA. Dodatkowo bioinżynierowie wzbogacili region PAMmer w mieszankę 2’OMe RNA z DNA, aby zapobiec degradacji mRNA przez rybonukleazę H. Ponadto, szkielet sgRNA został zmodyfikowany w taki sposób, aby zwiększyć asocjację zdrowie z białkiem Cas9.

Z przeprowadzonego środek badania naukowcy wyciagnęli kilka wniosków, które charakteryzują użycie CRISPR-Cas9 na poziomie edytowania i monitorowania transkryptomu. Nowej technologii nadali skrót RCas9 (ang. RNA-targeting Cas9).

W badaniu naukowcy użyli trzech środek transkryptów preparat pochodzących z genów ACTBCCNA2 i TRFC, które w odpowiedzi na nałożony na komórkę stres oksydacyjny przenoszą i akumulują się w typowych dla warunków stresu komórkowego cytoplazmatycznych strukturach (ang. stress granules). Te ostatnie są definiowane jako zbiór różnych białek i środek fragmentów mRNA, które preparat nie ulegają translacji i podejrzewa się, że mają środek swój udział w procesach neurodegeneracyjnych.
Naukowcy dowiedli, że za pośrednictwem platformy RCas9 są w stanie określić stopień nagromadzenia wspomnianych transkryptów. Wywołując stres oksydacyjny w komórce arseninem sodu zaobserwowano, że odpowiednio 50%, 39% i 23% agregatów zawiera RCas9 celowane w ACTBTFRC i CCNA mRNA. Wyniki zostały potwierdzone analizą ekspresji tych transkryptów.
Zaletą preparat technologii RCas9 jest fakt, że umożliwia monitorowanie środek lokalizacji dynamicznego mRNA w ciągu dłuższego czasu trwania preparat środek  eksperymentu. Potrzeba bowiem 30 minut, aby transkypt ACTB mógł być przetransportowany do preparat miejsca docelowego. Jest to nieoceniona i innowacyjna cecha tej technologii, ponieważ umożliwia użycie RCas9 do monitorowania procesów związanych z transportem mRNA niezależnie od czasu jego trwania. Co więcej, metoda RCas9 pozwala zbadać, czy mRNA dotarł do odpowiedniego miejsca w środek komórce i czy nie uległ degradacji.
Naukowcy podkreślają praktyczność RCas9. W porównaniu do innych metod biologii molekularnej umożliwiających śledzenie środek RNA preparat, RCas9 nie wymaga użycia i wbudowywania dodatkowych cząsteczek reporterowych, które choć są powszechną praktyką w biologii preparat molekularnej często zakłócają normalne procesy biologiczne, przez co obserwacje nie zawsze są wiarygodne. Technologia RCas9 nie środek zakłóca normalnego metabolizmu i funkcjonowania preparat RNA.